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CRISPR工具

CRISPR工具是一套基因编辑设计工具，帮助研究人员快速设计和分析CRISPR-Cas9系统的gRNA（向导RNA），提高基因编辑实验的成功率和效率。

功能概述​

CRISPR工具提供以下核心功能：

  • 从基因组导入序列：支持根据基因ID/名称或染色体位置导入序列
  • gRNA设计：自动设计高效的向导RNA序列
  • 脱靶分析：预测潜在的脱靶位点和错配信息
  • 引物设计：自动生成PCR验证引物
  • 结果保存：将设计结果保存到序列文件中

工具入口​

访问CRISPR工具​

  1. 进入"分子生物学工具"模块
  2. 打开一个序列文件
  3. 点击"CRISPR工具"选项
  4. 开始使用CRISPR设计功能

工具入口

从基因组导入序列​

根据基因ID或名称导入​

通过基因标识符或名称从基因组数据库中导入目标序列：

  1. 选择基因组版本：

    • 从下拉列表中选择目标物种的基因组版本
    • 支持的基因组版本：
      • Homo sapiens (hg19)
      • Homo sapiens (hg38)
      • Mus musculus (mm10)
      • Mus musculus (mm39)

  2. 输入基因信息：

    • 在"基因ID或名称"输入框中输入目标基因
    • 系统支持模糊搜索，快速匹配基因列表
    • 搜索结果显示详细信息：
      • 基因名称及别名
      • 所属染色体
      • 染色体起始位置
    • 从搜索结果中选择目标基因

  3. 选择转录本：

    • 系统会显示该基因在选定基因组中的所有转录本
    • 从下拉列表中选择目标转录本
    • 不同转录本可能包含不同的外显子组合

  4. 导入序列：

    • 点击"导入"按钮
    • 系统自动生成序列文件，包含序列信息和特征注释

根据基因ID导入

根据染色体上位置导入​

通过指定染色体坐标精确导入目标区域序列：

  1. 选择基因组：

    • 从下拉列表中选择基因组版本
    • 支持人类hg19/hg38和小鼠mm10/mm39

  2. 选择染色体：

    • 根据选定基因组，显示可用染色体列表
    • 从下拉列表中选择目标染色体

  3. 设置位置范围：

    • 起始位置：输入染色体起始坐标
    • 结束位置：输入染色体结束坐标
    • 系统会验证位置是否在染色体范围内
    • 序列长度限制：最大50,000 bp

  4. 导入序列：

    • 点击"导入"按钮
    • 系统从基因组数据库中提取指定区域序列

CRISPR设计​

添加Guide目标区域​

默认目标区域​

从转录本导入：

  • 如果选择了转录本，系统会自动将所有外显子区域添加到Guide目标区域
  • 可以手动添加或删除目标区域

自定义目标区域：

  • 可以手动指定目标区域的起始和结束位置
  • 支持添加多个不连续的目标区域

Guide目标区域

Guide生成操作​

参数检查与设置​

  1. 生成Guide操作：

    • 点击"生成Guide"按钮
    • 如果未设置Guide参数，系统会自动提示并弹出"Guide参数"设置框
    • 必须完成参数设置后才能继续生成操作

  2. Guide合并策略：

    • 当选择多个Guide时，系统会自动合并序列
    • 系统会自动扩展序列范围以便后续引物设计

  3. 长度限制：

    • 当选择多个Guide时，系统会检查合并后的总长度
    • 如果长度超过800bp，将无法生成引物
    • 系统会提示用户减少Guide数量或调整选择范围

Guide参数设置​

基本参数​

gRNA长度：用于设置gRNA的长度，默认20nt

基因组选择：用于匹配目标基因组的mismatch值

PAM序列类型：

  • 用于选择Cas蛋白的PAM序列
  • 提供预设选项：NGG、NRG等
  • 自定义选项：选择"自定义"后，展示自定义PAM参数设置
    • 支持输入自定义PAM序列
    • 可设置PAM位置和方向

Guide参数设置

引物参数配置​

基本参数设置​

参数说明​

字段说明默认值
长度引物碱基长度范围18-25 bp
GC%引物 GC 含量范围40-60%
Tm引物熔解温度范围57-63°C
3′端 GC 重复数引物 3′ 端最大连续 G/C 数≤3
引物与目标区域距离 (bp)引物可放置的坐标区间50-300 bp
扩增子长度PCR 产物长度范围200-500 bp
引物对数设计引物对的数量5对
上下游扩展长度从参考基因组截取模板时，两侧上下游扩展序列的长度500 bp

引物参数配置

引物设计与保存​

引物生成​

  1. 选择gRNA：

    • 从候选列表中选择1-2条高质量的gRNA
    • 可以选择多条gRNA进行比较
    • 系统会检查选择的gRNA合并后的总长度

  2. 参数验证：

    • 系统自动验证引物参数的合理性
    • 检查目标区域长度是否超过800bp限制
    • 如果超出限制，提示调整gRNA选择或参数设置

  3. 生成引物：

    • 点击"生成引物"按钮
    • 系统根据设置的参数自动设计PCR引物
    • 引物会覆盖gRNA目标切割位点

  4. 引物验证：

    • 检查引物的Tm值、GC含量等参数
    • 确认扩增子长度符合要求
    • 验证引物特异性

引物设计结果

保存引物​

保存到序列文件​

  1. 选择满意的引物对
  2. 点击"保存引物"按钮
  3. 引物信息会保存到当前序列文件中
  4. 包含引物序列、位置和参数信息